ABSTRACT Yellow fever is an arthropod-borne viral disease that still poses high public health concerns, despite the availability of an effective vaccine. The development of recombinant viruses is of utmost importance for several types of studies, such as those aimed to dissect virus-host interactions and to search for novel antiviral strategies. Moreover, recombinant viruses expressing reporter genes may greatly facilitate these studies. Here, we report the construction of a recombinant yellow fever virus (YFV) expressing Gaussia luciferase (GLuc) (YFV-GLuc). We show, through RT-PCR, sequencing and measurement of GLuc activity, that stability of the heterologous gene was maintained after six passages. Furthermore, a direct association between GLuc expression and viral replication was observed (r2=0.9967), indicating that measurement of GLuc activity may be used to assess viral replication in different applications. In addition, we evaluated the use of the recombinant virus in an antiviral assay with recombinant human alfa-2b interferon. A 60% inhibition of GLuc expression was observed in cells infected with YFV-GLuc and incubated with IFN alfa-2b. Previously tested on YFV inhibition by plaque assays indicated a similar fold-decrease in viral replication. These results are valuable as they show the stability of YFV-GLuc and one of several possible applications of this construct.

As infecções causadas por dengue representam uma das mais prevalentes doenças transmitidas por artrópodes mundialmente, causando um amplo espectro de manifestações clínicas. A tecnologia de clones infecciosos é uma importante ferramenta para o entendimento da biologia do vírus da dengue (DENV). Clones de cDNA infeccioso têm sido construídos para muitos vírus de RNA com cadeia positiva e são ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na replicação do genoma viral, montagem da partícula viral, patogênese viral, e desenvolvimento de vacinas. No presente trabalho, nós descrevemos o desenvolvimento de um clone infeccioso baseado num isolado primário brasileiro do vírus Dengue sorotipo 3 (DENV3), genótipo III. Usando uma estratégia de dois plasmídeos, o genoma viral foi dividido em duas partes e os fragmentos gerados foram clonados separadamente num vetor shuttlelevedura-bactéria. Os plasmídeos foram construídos pela técnica de recombinação homóloga em levedura e a transcrição do genoma completo foi realizada a partir ligação in vitro das duas partes do genoma. O transcrito de DENV3 se mostrou infeccioso quando transfectado em células BHK-21 e a identidade do clone infeccioso foi confirmada por caracterização in vitro. A cinética de crescimento do DENV3 gerado neste sistema foi indistinguível do vírus parental. Este sistema representa uma poderosa ferramenta que ajudará na elucidação de aspectos moleculares da biologia do DENV bem como no estudo de mutações associadas com patogênese do DENV.

Dengue infections represent one of the most prevalent arthropod-borne diseases worldwide, causing a wide spectrum of clinical outcomes. Engineered infectious clone is an important tool to study Dengue virus (DENV) biology. Functional full-length cDNA clones have been constructed for many positive-strand RNA viruses and have provided valuable tools for studying the molecular mechanisms involved in viral genome replication, virion assembly, virus pathogenesis and vaccine development. We report herein the successful development of an infectious clone from a primary Brazilian isolate of dengue virus 3 (DENV3) of the genotype III. Using a two-plasmid strategy, DENV3 genome was divided in two parts and cloned separately into a yeast-bacteria shuttle vector. All plasmids were assembled in yeast by homologous recombination technique and a full-length template for transcription was obtained by in vitro ligation of the two parts of the genome. Transcript-derived DENV3 is infectious upon transfection into BHK-21 cells and in vitro characterization confirmed its identity. Growth kinetics of transcript-derived DENV3 was indistinguishable from wild type DENV3. This system is a powerful tool that will help shed light on molecular features of DENV biology, as the relationship of specific mutations and DENV pathogenesis.

O replicon de RNA derivado do genoma de Flavivirus é uma ferramenta valiosa para o estudo de replicação viral independente da montagem e da maturação do virion, além de possuir um grande potencial para expressão de genes heterólogos. Neste estudo nós descrevemos a construção de replicons subgenômicos do vírus da febre amarela utilizando a técnica de recombinação homóloga em levedura. O plasmídeo contendo o replicon do vírus febre amarela cepa 17D (pBSC-repYFV-17D), caracterizado anteriormente, foi manipulado para a expressão heteróloga dos genes repórteres green fluorescent protein (repYFV-17D-GFP) e firelly luciferase (repYFV-17D-Luc). Ambos os replicons foram construídos por recombinação homóloga entre o vetor pBSC-repYFV-17D linearizado e o produto de PCR contendo 25 nucleotídeos terminais homólogos incorporados aos oligonucleotídeos iniciadores. A organização genômica dos construídos é semelhante ao repYFV-17D, com inserção de um gene repórter entre os restantes 63 nucleotídeos N-terminais da proteína do capsídeo e 72 nucleotídeos C-terminais da proteína E. Os replicons repYFV-17D-GFP e repYFV-17D-Luc mostraram uma eficiente replicação e expressão dos genes repórteres. A técnica de recombinação homóloga em levedura usada neste estudo demonstrou ser aplicável à manipulação do genoma do vírus da febre amarela para a construção de replicons subgenômicos.

RNA replicon derived from Flavivirus genome is a valuable tool for studying viral replication independent of virion assembly and maturation, besides being a great potencial for heterologous gene expression. In this study we described the construction of subgenomic replicons of yellow fever virus by yeast-based homologous recombination technique. The plasmid containing the yellow fever 17D strain replicon (pBSC-repYFV-17D), previously characterized, was handled to heterologous expression of the green fluorescent protein (repYFV-17D-GFP) and firefly luciferase (repYFV-17D-Luc) reporter genes. Both replicons were constructed by homologous recombination between the linearized vector pBSC-repYFV-17D and the PCR product containing homologous 25 nucleotides ends incorporated into PCR primers. The genomic organization of these constructs is similar to repYFV-17D, but with insertion of the reporter gene between the remaining 63 N-terminal nucleotides of the capsid protein and 72 C-terminal nucleotides of the E protein. The replicons repYFV-17D-GFP and repYFV-17D-Luc showed efficient replication and expression of the reporter genes. The yeast-based homologous recombination technique used in this study proved to be applicable for manipulation of the yellow fever virus genome in order to construct subgenomic replicons.

O manejo de pacientes infectados pelo dengue ainda é um problema desafiador. A maioria dos casos de dengue é benigna mas parte desses casos pode evoluir para o desenvolvimento de vasculopatia severa conhecida como dengue hemorrágica, que pode ser letal. Os sintomas iniciais da dengue e sua forma hemorrágica são bastante similares. O desenvolvimento de um teste diagnóstico que seja rápido e capaz de diferenciar as duas formas clínicas da dengue é crucial para o cuidado adequado de pacientes. O presente estudo avalia, através da PCR quantitativa em tempo real, o potencial preditivo dos níveis de expressão de RNAm candidatos a marcadores da dengue hemorrágica, previamente identificados por estudos genômicos funcionais. Um conjunto de seis marcadores moleculares para a dengue hemorrágica foi avaliado e apresentou correlação entre seus níveis de transcrição e o posterior desenvolvimento da vasculopatia severa. Os marcadores selecionados foram capazes de indicar, nos momentos iniciais dos sintomas, a evolução de um paciente infectado pelo dengue para a forma severa da doença. O painel de candidatos a marcadores de prognóstico obtido demonstrou um bom potencial para uso clínico na forma de um ensaios rápido baseado em amostras de sangue.

The management of acute dengue patients during outbreaks is a challenging problem. Most of the dengue fever cases are benign, but some cases develop into a severe and possibly lethal vasculopathy, known as dengue hemorrhagic fever. Early symptoms of dengue and hemorrhagic fever are very similar. An early differential diagnosis is needed to predict which of these two clinical presentations is crucial to proper patient care and public health management. This study evaluates the predictive potential of specific mRNA expression markers of dengue hemorrhagic fever using quantitative real-time PCR assays. Six candidate "dengue hemorrhagic fever specific signature genes" were evaluated and all showed good correlation among their transcription levels at early days of infection and the later development of severe vasculopathy. The markers selected were able to indicate, at early stages of infection, the evolution of a dengue-infected patient to the severe form of the illness. Despite the fact that these results grant further validation studies, the panel of candidate prognostic markers obtained demonstrated the potential to be useful for clinical use in the form of a fast assay based in blood samples.

Amostras do vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV), denominadas de BVDV tipo 2 (BVDV-2), foram inicialmente identificadas em surtos de BVD aguda e enfermidade hemorrágica e têm sido isoladas predominantemente na América do Norte. O presente artigo descreve dois casos de enfermidade gastroentérica/respiratória seguidos de isolamento e identificação de amostras de BVDV tipo 2 no sul do Brasil. Os vírus foram isolados de duas novilhas de diferentes rebanhos. Um dos animais apresentou enfermidade aguda, cursando com anorexia, atonia ruminal, diarréia escura ou muco-sanguinolenta, tenesmo e descarga nasal muco-purulenta. O outro animal desenvolveu enfermidade de longa duração (7 meses), caracterizada por crescimento retardado, anorexia, quadros recorrentes de diarréia, dermatite interdigital, hemorragias digestivas e genitais ocasionais, conjuntivite, artrite e pneumonia crônica. Congestão disseminada das mucosas, ulcerações extensivas e profundas na língua, palato e esôfago, áreas necróticas na mucosa do rúmen, áreas de congestão e ulcerações cobertas com fibrina no intestino delgado foram os achados mais proeminentes. Antígenos do BVDV foram demonstrados por imunohistoquí-mica no epitélio da língua, nos pulmões e em linfonodos mesentéricos. Amostras não-citopáticas do BVDV foram isoladas em cultivo celular a partir de leucócitos e do baço dos animais afetados e identificadas por imunofluorescência. Caracterização antigênica e análise filogenética desses isolados, e de outras duas amostras de BVDV isoladas de fetos coletados em matadouros, revelou tratar-se de BVDV tipo 2. A presença do BVDV tipo 2 na população bovina do Brasil possui um significado epidemiológico importante e pode ter conseqüências para o diagnóstico, estratégias de imunização e produção de vacinas.

Highly virulent bovine viral diarrhea virus (BVDV) isolates, named BVDV type-2 (BVDV-2), were initially identified in outbreaks of acute and hemorrhagic BVD and have been previously isolated mainly in North America. The present article describes two cases of gastroenteric/respiratory disease in southern Brazil from which BVDV type 2 viruses were isolated. The viruses were isolated from two heifers belonging to different herds. One animal developed an acute disease, characterized by anorexia, ruminal atony, dark to bloody diarrhea, tenesmo and mucopurulent nasal discharge. The other animal developed a long lasting disease (7 months), characterized by retarded growth, anorexia, recurrent episodes of diarrhea, interdigital dermatitis, occasional digestive and genital bleeding, conjuntivitis, arthritis and chronic pneumonia. Disseminated mucosal congestion, extensive and deep ulcerations in the tongue, palate and esophagus, necrotic areas in the ruminal mucosa, areas of congestion covered with fibrin in the small intestine were the most prominent findings. BVDV antigens were detected by immunohistochemistry in the tongue epithelium, lungs and in mesenteric lymph nodes. Non-cytopathic BVD viruses were isolated from white blood cells and spleen from the affected animals through inoculation of cultured cells and demonstration of viral antigens by immunofluorescence. Subsequently, antigenic characterization and phylogenetic analysis of these – plus two BVD viruses that have been isolated from healthy fetuses – allowed their classification into the genotype 2. The presence of BVDV-2 among Brazilian cattle is epidemiologically relevant and may have important implications for diagnosis, immunization strategies and vaccine production.